S.N.V. biologie cellulaire le noyau
Chapitre 3. La chromatine
I. Observation du contenu du noyau
II. Les histones
III.Le complexe ADN-Histone
1. Structure répétitive
2. Le nucléosomes
3. La fibre chromatinienne
4. Rôle des topoisomérase
Chapitre 3. La Chromatine
A l'intérieur de l'enveloppe nucléaire, en dehors du nucléole, après coloration des
nucléoprotéines on distingue un ensemble de fibres formant des régions condensées ou dispersées
très variables apparement qui correspondent à l'empaquetage du matériel génétique par des
protéines, ces complexes étant structurés par la matrice nucléaire et ancrés sur celle ci.
C'est ainsi que les 2m d'ADN double brin se trouvent rassemblés dans une pshère de diamètre
inférieure à 10>m.
Il y a deux grands types de structure:
➢ Chromatine dispersée: volume important dans laquelle la coloration est peu dense et
sans éléments structurant visible.
➢ Hétérochromatine: Structure dense fortement coloré
I. Observation du contenu du noyau
➢ Le matériel nucléaire extranucléolaire peut etre isolé par centrifugation, après solubilisation
de l'enveloppe nucléaire en présence d'une force ionique physiologique et de cations
divalents necessaire à la préservation de la condensation du matériel nucléoprotéique.
➢ On retrouve environ deux fois plus de protéines que d'ADN (il n'y a pas de Lipide) parmi
lesquelles on considère ls machinerie de la transcription, de la réplication, de la réparation.
➢ Environ la moitié des protéines nucléaires est formé par les histones.
Donc il y a autant d'ADN que de protéine matricielle. L'autre moitié sont non matriciel et ont des
activité enzymatique.
I. Les histones
➢ Masse 10 kDa pour H2A, H2B, H3 et H4 riches en lysine et arginine.
➢ Les extrémités N-Terminale sont chargées positivement et peu structurées.
➢ Les histone H1 de masse plus élevée 20 kDa
➢ H3 et H4 sont les histones les plus conservées
➢ Forte conservation des séquences chez les eucaryotes
➢ Les gènes histones sont répété et transcrit de facon coordonée en liaison avec le cycle
cellulaire lors de la phase S
Les histones sont modifiées après leur synthèse:
➢ Acétylation de H1, H2A et H4 induite lors d'une stimulation de la transcription
(lysine). Cette modification localisée est fortement associé à l'expression de gènes: 13
lysines des extrémités N-Terminales peuvent être acétylées de facon réversible
➢ Phosphorylation de trois sérines des histones H3 et H4, et phosphorylation de H1
correlée notament avec la division cellulaire.
➢ Trois arginines des histone H3 et H4 peuvent être méthylées (inhibition de
transcription)
➢ Deux résidus des extrémités C-Terminales des histones H2A et H2B peuvent etre
ubiquitynilées.
➢ Charge basique lysine et Arginine qui permet l'interaction avec l'ADN. La phosphyrlation
et acetylation cache le groupement basique et empeche l'interaction
Les histones sont transcrit indépendament les uns des autres, il y a des promoteurs pour
chaque SU, contrairement au 45S.
Chaque promoteur fonctionne de facon coordoné au moment de la phase S.
Chez l'homme la famille des gènes histones comprend plus de 60 copies dont deux ensembles
majoritaires sur le bras court du Chromosome 6.
Les quatres histones H3, H4, et H2A H2B forment spontanément un double hétérotétramère en
solution comme démontré par:
➢ Fractionnement et pontage: Octamère (H3H4)2 - H2A2 - H2B2
➢ Purification à partir de noyaux ou de nucléoprotéines
➢ Expérience de pontage (liaison covalente entre les protéines)
➢ Isolation par gradient en présence de force ionique élevée.
L'ensemble des cellules eucaryotes contient des octamères d'histone des unicellulaires aux hommes
ou plantes.
➢ L'octamère est toujours basique et est lié avec l'ADN par des liaison Ionique fortes (1,2 -
2 M de NaCl), cad les histones H3, H2a H2b et H4.
➢ L'ADN double brin s'enroule autour du coeur histone.
➢ L'histone H1 est particulière et interagit avec l'ADN et le complexe Octamère-ADN par
des liaisons ioniques. (0,6M NaCl)
➢ Les histones sont présentes dans le noyau interphasique et les chromosomes.
➢ Chez l'homme, les histones sont présentes dans toute cellule l'exception du
spermatozoïdes dans lequel les histones ont été réplacées par de petites protéines
basiques, structurées par leur interaction avec l'ADN: les protamines (ex: spermine). Après
fertilisaiton il y a remplacement des protamines par des histones néosynthéthisées.
II. Le complexe ADN-Histone
Les interactions entre ADN-Histone sont de type ionique et donc dissocié par une élévation
de la force ionique. Au dela de 2M de NaCl on n'isole plus que l'ADN déprotéinisé.
Les histones sont dissociées de l'ADN progressivement: de 0,4 a 1,5 M NaCl à pH neutre.
L'ADN est protégé par l'action des DNAse par les histones: cette protection permet de voir une
structure répétée
1. Structure répétitive
Celle ci formée par les interactions histones-ADN comme le montrent les expérience d'isolement et
de reconstitution.
La digestion par une DNAse génère des fragments multiples d'une longueur unitaire de 200pb.
Elle n'a pas dissocié les complexes: ADN-Histones.
On le voit sur un gel d'agarose: les structures séparées sont des multiples de 200pb et sont donc
le reflet de la structure nucléoprotéique géré par l'interaction histone-ADN.
Ceci est généré par l'action de DNAse sur des noyaux, mais ce phénomène existe in vivo lors de
mort cellulaire: production et activation de DNAse qui produisent des multiple de 200pb, généré
par les coupures double brins entre ces structures formées par ADN-Histone
2. Le nucléosomes
Structure présente dans le noyau et isolable après digestion aux DNAses et fractionnement sur
gradient. Retrouvé dans tout les organsisme eucaryotes.
Dimension disque de 12nm de diamètre et 7 nm d'épaisseur
Structure native reconstituée à partir d'ADN et d'histone purifiée: l'octamère d'histone s'associe à
l'ADN (environ 200pb d'ADN soit 64 nm sont associées à l'octamère en solution).
Les protéines basiques vont interagir fortement de manière ionique avec l'ADN
➢ Présence d'une structure répétée dans le noyau ou la chromatine: la meme structure existe
dans le noyau de la cellule intacte
➢ Digestion ménagée aux DNAses: obtention de multiple d'environ 200pb (nx200pb)
➢ Environ 200pb associée aux histones correspond au monomère de la structure répétée ou
nucléosomes.
L'ADN est à l'extérieur de l'octamère, enroulé autour du coeur d'histone contrainte équivalent à un
supertour négatif.
L'interaction Histone-ADN se fait sur les base AT, ce sont les régions protégées des Dnases. Il y
aura des régions d'ADN accessible GC riche. Une digestion poussée donnera des coupure de 10pb
Une digestion poussée aux Dnases produit une structure nucléoprotéinque résistante: le coeur du
nucléosome (nucléosomal core), H1 non présente
ADN nucléosomique est asccessible à la Dnase I qui génère des coupure simple brin espacées de
10 nucléotides.
Structure nucléosomique reconstituée in vitro:
➢ Association H2A H2B H3 H4 avec ADN en solution: diminution de la force ionique:
interaction ionique (1-1,5 NaCl)
➢ Raccourcissement apparent de l'ADN un nucléosome contient environ 200pb ou 68nm
➢ Formation de structure 11nm x 7nm
➢ En présence d'un ADN fermé covalent: formation de nucléosome induit une contrainte de
torsion: il y aura une gestion des contraintes de facon à ne pas gener la transcription
cellulaire et la division cellulaire
Localisation et rôle de l'histone H1: 1 exemplaire H1 pour 2 H4 H3 H2a H2b
➢ Localisée au point d'entrée et de sortie du nucléosome
➢ Interaction entre les histones H1 des differents nucléosomes
➢ Stabilise la structure nucléosomique (DNAses) et stabilise les interactions entre
nucléosomes.
➢ Participe à la compaction de al fibre chromatinienne (effet de la force ionique et cations
divalents avec notament l'extrémité N-terminale de l'histone H4
➢ Stabilise les intéractions inter-nucléosomiques
➢ Seule histone facilement échangeable (force ionique entre 0,4 et 0,6 NaCl)
Modification de l'interaction
➢ Phosphorylation de H1 au cours du cycle cellulaire qui entraine un changement des
interactions: compaction de la fibre chromatinienne.
Essentiellement toute séquence génomique est trouvées dans une structure nucléosomique (sauf
dans le spz qui a des protamines): Toute les séquence nucléosomique ne présentent pas la même
sensibilité aux Dnase (chromatine active)
3. La fibre chromatinienne
➢ Repliement du chapelet de perles de 11nm
➢ Formation d'un filament de 30nm de diamètre moyen structure dynamique et flexible
➢ L'histone suit le modèle du solénoïde en hélice droite, six nucléosome par tour
➢ L'histone H1 permet une compaction supplémentaire
➢ due aux interactions nucléosome/nuclosomes (octamère/octamère) ET au rôle des histones
H1 et
➢ L'ADN est toujours accessible sur les nucléosome entre ceux ci par les ADNpol, ARN
polymérase.
➢ Certaines séquences vont être en rapport plus facilement
Différents niveaux dempaquetage de l'ADN nucléaire
➢ Double brin
➢ Formation d'histone en chapelet de perle
➢ Formation de solenoIde
➢ Formation des boucles de fibre chromatinienne: 20 000 - 70 000 pb par boucle
➢ Les boucles sont replié sur elle-même
➢ Les boucles forment le chromosome.
Ancrage des boucles de fibre chromatinienne sur la matrice nucléaire qui est associé à la lamina.
La matrice est isolée comme structure nucléiare non solubilisée par les détergents, dnase et haute
force ionique. Elle contient les lamines, des microfilaments d'actine
Isolement après digestion Dnasique poussée et purification en présence de force ionique élevée des
séquence SAR ou MAR (au niveau des chr ou noyau interphasique) riche en AT qui sont des
séquence d'attachement de l'ADN sur la matrice. Il va y avoir une localisation spécifique de
differentes zone localisé dans la fibre chromatinienne. Régions voisines des séquences de
régulation de l'expression génétique et d'origines de réplication, présence de Toposiomérase II
notament.
Les séquences MAR dépendent du type cellulaire (différentiation) et du niveau d'activité (tous les
MAR ne sont pas utilisés)
➢ Sont ainsi définis les domaines chromatiniens de 30 à 80 000 pb: domaine structuraux et
fonctionnels présents dans le noyau interphasique ET dans les chromosome (squelette du
chromosome)
➢ Il est possible d'enlever les histones et maintenir la fixation des boucles d'ADN:
visualisationdes boucles d'ADN
Organisation des domaines chromatinien dans les chromosomes en écouvillon d'amphibien. La
compaction/décompaction de l'ADN chromatinient reflete le degrés d'activité de certaines zone de
l'ADN.
L'ADN total est une juxtaposition d'ADN chromatinien. Dans les structure unitaire et la fibres,il y a
des contraintes de torsion que al cellule doit gerer pour l'accessibilité
III.Rôle des topoisomérase
Les domaines chromatiniens forment donc des oucles de fibres chromatinienne équivalents à des
domaines fermées (ADN circulaire fermé covalent)
Les contraintes topologique au cours de la transcription et de la réplication sont gérées à l'intérieur
du domaine
➢ Présence de Topoisomérase II au niveau des points d'ancrage: double brin transitoire
➢ Présence de Toposisomérase I dans le nucléoplasme: simple brin transitoire
Une structure plus compacte freine les mécanisme de réplication et transcriptions.
La TopoisoméraseI est necessaire à la transcription G1/G2, la TopoisoméraseII est utile en S et
division cellulaire M. Ces même enzyme peuvent ensuite liger les brin qui ont été séparé.
Les contraintes peuvent évoluer: en cercle relaché, supertour négatif ou dedistribution
Une molécule qui s'intercale dans la strucure formera en amont des supertour négatif et en aval
des supertours positif: la topoisomérase enlève les contrainte induites par les supertours.
La topoisomérase de type II: il existe des contrainte qui ne peuvent être résolue que par la
coupure simultanée des deux brins. La réplication d'une boucle d'ADN double brin donnera une
structure entriquées qui ne pourra etre résolue que par la topoisoméraseII: si elle n'existe pas, il
ne peut pas y avoir de séparation des brins répliqué.
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